Aspiracija jajnih ćelija i embriotransfer predstavljaju dva ključna trenutka VTO postupka za pacijente. Ono što se dešava između ova dva trenutka uglavnom ostaje iza vrata embriološke laboratorije.
Tokom tih nekoliko dana embriolozi obrađuju jajne ćelije i spermatozoide, prate oplodnju i razvoj embriona, a zatim donose odluku o njihovoj daljoj kultivaciji, selekciji, transferu ili zamrzavanju.
Prvi susret sa jajnim ćelijama
Rad počinje praktično istog trenutka kada ginekolog tokom aspiracije prikupi folikularnu tečnost, koja iz operacione sale odmah stiže u laboratoriju, gde embriolog pod mikroskopom pronalazi komplekse jajnih ćelija okružene kumulusnim ćelijama. Pronađene jajne ćelije prebacuju se u odgovarajuće medijume i inkubatore, u kojima se održavaju precizno kontrolisani uslovi temperature, pH i koncentracije gasova. Cilj je da uslovi kojima su izložene jajne ćelije i kasnije embrioni budu što stabilniji tokom čitavog perioda kultivacije.
Nakon aspiracije, jajne ćelije se smeštaju u odgovarajući medijum i ostavljaju u strogo kontrolisanim uslovima inkubatora do trenutka oplodnje. Dalja priprema zavisi od toga da li je planiran klasičan IVF ili ICSI. Kod klasičnog IVF-a jajne ćelije ostaju okružene kumulusnim ćelijama i u medijum se dodaje odgovarajući broj prethodno pripremljenih pokretnih spermatozoida.
Tokom zajedničke inkubacije, spermatozoidi prolaze kroz kumulus i doprinose razdvajanju veza između kumulusnih ćelija, što je deo procesa koji prethodi oplodnji. Narednog dana, jajne ćelije se izdvajaju iz inseminacionog medijuma, prebacuju u svež medijum i procenjuje se da li je došlo do normalne fertilizacije. Za razliku od klasičnog pristupa, kod ICSI procedure se uklanjaju kumulusne ćelije koje okružuju jajnu ćeliju, čime se mogu precizno proceniti njena zrelost i izdvojiti zrele, MII oocite spremne za mikroinjekciju spermatozoida.
Šta se dešava sa uzorkom semena?
Paralelno sa pripremom jajnih ćelija, obrađuje se i uzorak semena. Ejakulat se ne koristi direktno za oplodnju, već moramo da ga obradimo. Cilj laboratorijske obrade je da iz uzorka izdvojimo pokretne i funkcionalno kvalitetnije spermatozoide, a zatim i uklonimo seminalnu plazmu, nepokretne ćelije i druge neželjene komponente.
Način obrade semena određujemo individualno, na osnovu karakteristika konkretnog uzorka i relevantnih podataka iz anamneze. Pored standardnih metoda, kao što su gradijent gustine i swim-up, kod određenih pacijenata mogu se primeniti i dodatne metode selekcije spermatozoida.
Za embriologa, spermogram zato nije samo broj na izveštaju. Način na koji ćemo obraditi uzorak zavisi od njegove koncentracije, pokretljivosti i drugih karakteristika, ali i od metode oplodnje koju planiramo.
IVF ili ICSI?
Odluka da li će se primeniti ICSI ili klasičan IVF donosi se individualno za svaki par. Pored parametara spermograma, uzimaju se u obzir reproduktivna istorija para, ishodi prethodnih pokušaja, ukoliko ih je bilo, kao i drugi faktori koji mogu uticati na verovatnoću uspešne fertilizacije. Kod izraženog muškog faktora infertiliteta, veoma malog broja pokretnih spermatozoida ili određenih poremećaja fertilizacije iz ranijih pokušaja, klasičan IVF često nije optimalna opcija.
Kada za njegovu primenu postoje odgovarajući uslovi, klasičan IVF ima važnu prednost - omogućava da spermatozoidi sami prođu kroz procese selekcije i penetracije jajne ćelije, bez direktnog izbora pojedinačnog spermatozoida od strane embriologa. Jajna ćelija se kultiviše sa određenim brojem prethodno pripremljenih spermatozoida, a do oplodnje dolazi bez njihovog direktnog unošenja u jajnu ćeliju.
Kod ICSI procedure embriolog pod mikroskopom bira pojedinačni spermatozoid, imobilizuje ga i pomoću veoma tanke mikropipete unosi direktno u citoplazmu zrele jajne ćelije. ICSI je posebno značajan kod muškog faktora infertiliteta, ali postoje i druge indikacije za njegovu primenu.
U pojedinim, pažljivo odabranim situacijama može se razmatrati i rescue ICSI, odnosno naknadna primena ICSI-ja kada nakon klasičnog IVF-a izostanu očekivani znaci oplodnje.
Kako znamo da je došlo do oplodnje?
Sledećeg dana, odnosno dan nakon aspiracije, proverava se fertilizacija. Pravilno oplođena jajna ćelija, što je ishod kojem se nadamo, najčešće ima dva pronukleusa - jedan poreklom od jajne ćelije i drugi od spermatozoida - kao i dva polarna tela.
Međutim, oplodnja ne mora uvek izgledati potpuno pravilno. Ponekad se u jajnoj ćeliji uočava drugačiji broj pronukleusa ili drugi atipični obrasci fertilizacije. Takvi oociti i embrioni nastali iz njih, zahtevaju posebno pažljivu procenu, jer je njihov razvojni i reproduktivni potencijal generalno manji. Ipak, danas znamo da pojedini embrioni koji potiču iz atipično oplođenih oocita, u određenim situacijama i nakon odgovarajuće procene, mogu imati uredan hromozomski status i dovesti do uspešne trudnoće.
Važno je da pacijenti razumeju da broj jajnih ćelija nije finalni rezultat cele procedure. Tokom postupka vantelesne oplodnje neće svaka aspirirana jajna ćelija biti zrela, neće se svaka zrela jajna ćelija oploditi i neće svaki oplođeni oocit nastaviti pravilan razvoj do blastociste.
Naravno, to ne mora da znači da u laboratoriji nešto nije urađeno kako treba, već je to sastavni deo bioloških procesa koji postoje i u spontanoj reprodukciji, samo što ih tokom VTO postupka možemo direktno posmatrati.
Razvoj embriona
Nakon procene fertilizacije, pažnja embriologa usmerava se na dalji razvoj embriona. Tokom narednih nekoliko dana pratimo njegove deobe, dinamiku razvoja i morfološke karakteristike - broj i izgled ćelija, brzinu njihove deobe, stepen fragmentacije, sve do trenutka kada se donosi odluka o transferu ili zamrzavanju.
Trećeg dana, embrion se najčešće nalazi u fazi deobe, dok daljim razvojem prolazi kroz stadijum morule i može dostići stadijum blastociste petog ili šestog dana. Kod blastociste procenjujemo stepen ekspanzije, unutrašnju ćelijsku masu, iz koje će se dalje razvijati embrion/fetus, i trofoektoderm, iz kojeg će se najvećim delom formirati posteljica.
Razvoj embriona može se pratiti i kontinuirano pomoću time-lapse sistema, koji predstavljaju jednu od dodatnih tehnologija u VTO. Kontrinuiranim snimanjem ovi sistemi embriologu pružaju informacije o dinamici razvoja i vremenu pojedinih ćelijskih deoba, koje se ne mogu dobiti samo povremenom procenom embriona pod mikroskopom.
Kako biramo embrion?
Jedno od pitanja koje pacijenti često postavljaju jeste: „Koji je moj najbolji embrion?“
Odgovor nije uvek jednostavan. Morfologija je jedan od najvažnijih alata koje koristimo pri izboru embriona za transfer, ali nije apsolutni pokazatelj njegovog potencijala. Embrion odlične morfologije ne mora nužno dovesti do implantacije, dok i embrioni sa nešto nižom morfološkom ocenom mogu rezultirati urednom trudnoćom i rođenjem zdravog deteta.
Kada imamo više embriona, odluku o tome koji će biti izabran za transfer donosimo na osnovu svih informacija koje smo prikupili tokom njegovog razvoja, a kada je rađeno genetsko testiranje, u odluku se uključuje i taj rezultat.
Poslednji korak
Odluka o tome kog dana će embriotransfer biti urađen donosi se individualno, na osnovu trenutne situacije u laboratoriji - pre svega broja i kvaliteta embriona i dinamike njihovog razvoja. U obzir se uzimaju i reproduktivna anamneza para i ishodi prethodnih VTO postupaka, ukoliko ih je bilo. Na osnovu svih ovih informacija procenjuje se da li je opravdano nastaviti kultivaciju do stadijuma blastociste ili transfer planirati ranije. Zajedno sa ginekologom se procenjuje i pripremljenost materice za prijem embriona, što može uticati na odluku o vremenu transfera.
Na dan transfera embriolog priprema izabrani embrion i neposredno pre procedure uvlači ga u tanki transferni kateter. Ginekolog zatim pod kontrolom ultrazvuka postavlja spoljašnji kateter kroz grlić do njegovog ušća u matericu. U materičnu šupljinu obloženu pripremljenim endometrijumom se unutrašnjim transfernim kateterom oprezno vraća embrion.
Jedan mali, ali veoma važan detalj koji pacijenti uglavnom ne vide jeste da se kateter nakon transfera vraća embriologu, koji ga pod mikroskopom proverava kako bi potvrdio da embrion nije ostao u kateteru.
Kada embrione čuvamo za kasnije?
Kvalitetni embrioni koji nisu izabrani za svež transfer mogu se vitrifikovati i sačuvati za naredni postupak. Vitrifikacija je veoma brza metoda zamrzavanja kojom se sprečava formiranje kristala leda koji bi mogli oštetiti ćelije. Savremeni protokoli omogućavaju veoma visoku stopu preživljavanja odmrznutih embriona, zbog čega zamrzavanje embriona danas predstavlja važan deo rutinskog rada IVF laboratorije.
Ono što se iza vrata laboratorije ne vidi
Rad embriologa nije samo rad za mikroskopom. Iza svakog uzorka i svakog embriona postoji sistem precizne identifikacije i sledljivosti, kontrola inkubatora, temperature, gasova i medijuma, dokumentovanje svakog koraka i višestruke provere identiteta reproduktivnih ćelija i embriona.
U embriološkoj laboratoriji često radimo sa ćelijama koje se mere u mikrometrima, ali posledice svake odluke mogu biti ogromne. Zbog toga su standardizacija, kontrola kvaliteta, sledljivost i sigurnost jednako važni kao i sama laboratorijska tehnika.
Od trenutka kada jajna ćelija stigne u laboratoriju do trenutka kada se embrion vrati u matericu, iza svakog koraka stoji niz procena i odluka embriologa. Pacijent najveći deo tog procesa ne vidi, ali upravo se u laboratoriji tokom nekoliko dana odvijaju ključni segmenti VTO postupka.
Klinički embriolog Dušica Petrović poručuje: „Iza svakog embriona koji dobije svoju šansu stoje znanje, preciznost i odgovornost embriologa.“
